Práctica 2 y 3. Producción, separación y purificación de la enzima alfa-amilasa a partir de Saccharomyces cerevisiae por fermentación en medio sumergido.

Objetivos

General

Producir y purificar alfa-amilasa de Saccharomyces cerevisiae a través del cultivo en medio sumergido de la levadura para aplicar un protocolo de precipitación proteica.

Específicos

• Producir y separar alfa-amilasa a partir de Saccharomyces cerevisiae con ayuda de la separación extracelular, por centrifugación para precipitar la enzima a través del método conocido como salting out.
• Realizar un conteo celular de la levadura utilizando la cámara de Neubauer para conocer la densidad celular de la levadura.
• Realizar una cuantificación proteica con el método de Bradford.
• Determinación de azúcares reductores con el método DNS para determinar la actividad enzimática de alfa-amilasa.
• Preservar la enzima alfa-amilasa en buffer de fosfatos para su posterior utilización.

Introducción

Los aminoácidos son los monómeros de las proteínas, llevan tal nombre debido a que son derivados de ácidos carboxílicos. Se caracterizan por tener unidos grupos amino y carboxilo al mismo átomo de carbono, éste es conocido como el carbono (también conocido como carbono quiral, ya que se encuentran unidos a él 4 grupos diferentes), de igual a éste también se encuentran unidos otros sustituyentes como puede ser un átomo de hidrógeno y una cadena R, la cual es distinta para cada aminoácido (Horton, Moran, Scrimgeour, Perry & Rawn, 2008).

Una proteína se define como el conjunto de aminoácidos unidos mediante un enlace peptídico (covalente) o enlace péptido.Los aminoácidos se van uniendo a consecuencia de la interacción entre el grupo carboxilo del carbono (carbono quiral), con el grupo amino del carbono . Dependiendo del número de aminoácidos que lleguen a unirse, se puede formar un dipéptido, tripéptido, oligopéptido y polipéptido (Nelson & Cox, 2009).

En ocasiones llega a darse la posibilidad de que mitades de aminoácidos se unan a la cadena polipeptídica, estos reciben el nombre de residuos de aminoácido. En los nombres de los residuos se .sustituye la terminación -ina o -ato por -ilo o -il (utilizado sólo en nombres compuestos). De igual manera, toda cadena polipeptídica posee un grupo amino libre a al que se le conoce como N-terminal (terminal amino) y el grupo carboxilo libre se le identifica con el nombre de C-terminal (terminal carboxilo) (Nelson & Cox, 2009) .

Por otro lado, las proteínas presentan distintos niveles de estructura que son:

• Estructura primaria.
• Estructura secundaria
• Estructura  terciaria
• Estructura cuaternaria

En las cadenas laterales las interacciones entre residuos contribuyen a determinar la forma tridimensional y la estabilidad de una molécula de proteína (Nelson & Cox, 2009).

A las proteínas que sólo contiene aminoácidos y ningún otro grupo químico adicional se le considera como simples. Sin embargo las proteínas que contienen grupos químicos y estos están asociados con los aminoácidos se les conoce como conjugadas. a los grupos químicos mencionados anteriormente se les conoce como grupo prostético. Y a su vez las proteínas conjugadas se clasifican en lipoproteínas (contienen lípidos), glucoproteínas (contienen grupos glucídicos) y metaloproteínas (contienen un metal)  (Horton, Moran, Scrimgeour, Perry & Rawn, 2008).

La estructura primaria es la secuencia exacta de aminoácidos que forman una cadena peptídica, es de gran importancia ya que su formación determina la función que tendrá la proteína. La secundaria se refiere al  segmento de una cadena polipeptídica que describe el arreglo espacial local de los átomos de la cadena principal sin tomar en cuenta la conformación de su cadena lateral o su interrelación con otros segmentos, puede formar hélices y láminas por mencionar algunos ejemplos, y se unen mediante puentes de hidrógeno. La terciaria es la disposición de la estructura secundaria al plegarse sobre sí misma formando una conformación globular, pueden estar formadas por varios tramos de estructuras secundarias diferentes, existen las tipo fibrosos y las globulares, en este tipo de estructuras ya entran las que cuentan con sitio activo, quiere decir que son enzimas. Y las de estructura cuaternaria forman complejos proteicos, con enlaces débiles no covalentes de varias cadenas polipeptídicas de estructura terciaria (Kessel, 2010).

Las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica (Cremosi, 2002) que aceleran la velocidad de reacción hasta alcanzar un equilibrio. Constituyen el tipo de proteínas más numeroso y especializado, y actúan como catalizadores de reacciones químicas específicas en los seres vivos o sistemas biológicos. Los catalizadores son sustancias que aumentan la velocidad de las reacciones químicas sin que la enzima ni la reacción cambien en el proceso. Muchas de las enzimas no trabajan solas, se organizan en secuencias, también llamadas rutas metabólicas, y muchas de ellas tienen la capacidad de regular su actividad enzimática (Lehninger, Nelson & Cox, 2006).

Como se mencionó anteriormente, las enzimas son proteínas globulares formadas por una o más cadenas polipeptídicas plegadas, creando una “hondonada” donde encaja el sustrato, que es la sustancia sobre la que actúa la enzima, y tiene lugar la reacción. Esta zona de la enzima se denomina centro (o sitio) activo y sólo unos pocos aminoácidos están implicados en él (Figura 1).

Figura 1. Enzima con un sustrato (azul) unido al centro activo (hondonada) con un aminoácido clave del sitio activo (rojo)

El centro activo comprende dos sitios:

• El sitio de unión, formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el sustrato y,
• El sitio catalítico, formado por los aminoácido directamente implicados en el mecanismo de la reacción.

(Lehninger, Nelson & Cox, 2006).

La especificidad enzimática es una propiedad de las enzimas que se explica en parte por el modelo de llave y cerradura, propuesto por Emil Fischer en 1890. Cada enzima se une a un único tipo de sustrato debido a que el sitio activo y el sustrato poseen estructuras complementarias. La forma global del sustrato y su distribución de carga le permiten entrar e interactuar con el sitio activo de la enzima. Por otra parte, aunque la actividad catalítica de algunas enzimas sólo depende de las interacciones entre los aminoácidos del sitio activo y el sustrato, otras enzimas requieren componentes no proteicos para realizar sus actividades, como los cofactores enzimáticos que pueden ser iones, como el Mg2+ o el Zn2+ , o moléculas orgánicas complejas, denominadas coenzimas. El componente proteínico de una enzima que carece de un cofactor esencial se denomina apoenzima. Las enzimas intactas con sus cofactores unidos se denominan holoenzimas (McKee & McKee, 2009).

En la actualidad cada enzima se clasifica y se nombra según la clase de reacción que cataliza. En este esquema, instituido por la Unión Internacional de Bioquímica (IUB), a cada enzima se le asigna una clasificación de cuatro números y un nombre con dos partes denominado nombre sistemático. Las seis principales categorías de enzimas son:

1. Oxidorreductasas. Catalizan reacciones redox en las cuales cambia el estado de oxidación de uno o de más átomos en una molécula.
2. Transferasas. Transfieren grupos moleculares de una molécula donadora a una aceptora.
3. Hidrolasas. Catalizan reacciones en las que se produce la rotura de enlaces como C-O, C-N y O-P por la adición de agua.
4. Liasas. Catalizan reacciones en las que se eliminan grupos (p. ej., H2O, CO2 y NH3) para formar un doble enlace o se añaden a un doble enlace.
5. Isomerasas. Catalizan varios tipos de reordenamientos intramoleculares.
6. Ligasas. Catalizan la formación de enlaces entre dos moléculas de sustrato.

Las enzimas hidrolasas catalizan la división de un enlace covalente en el sustrato utilizando H2O como grupo atacante:

A–B + H2O → A–OH + B–H

Generalmente los enlaces de ataque son enlaces C-C, éster, amido, glucósido. Son llamadas de acuerdo al sustrato (Kessel, 2010). Este es el criterio utilizado por la IUBM (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Así, a cada enzima se le asigna un código que comienza por las letras EC (Enzyme Commission) seguido de una numeración de cuatro dígitos que especifica su actividad enzimática.

En la naturaleza existe una amplia variedad de enzimas responsables de la hidrólisis del almidón denominadas enzimas amilolíticos o amilasas. El almidón es un polímero de elevado peso molecular formado por una sucesión de moléculas de α-D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos α-1,4 y que se ramifica en determinados puntos de la cadena mediante enlaces α-1,6.

La amilasa es un enzima hidrolasa que tiene la función de digerir el glucógeno y el almidón para dar lugar a oligosacáridos, maltosa y finalmente glucosa (Machovic y Janecek, 2007). Los enzimas amilolíticos pueden clasificarse de diversas formas, por ejemplo, según el tipo de substrato y el producto que originan se dividen en α-amilasas, β-amilasas, glucoamilasas, pululanasas, isoamilasas, α-glucosidasas y ciclodextringlicosiltransferasas.

Según Henrissat (1991), las enzimas amilolíticas se distribuyen en tres familias: familias 13, 14 y 15 (Tabla 1).

Tabla 1. Esquema de las principales enzimas amilolíticas clasificados funcionalmente y según Henrissat (1991).

Esta clasificación, que se encuentra en el servidor denominado CAZy (por Carbohydrate Active Enzymes), incluye los tres tipos fundamentales de amilasas: α-amilasas, β-amilasas y glucoamilasas, que constituyen tres familias bien diferenciadas (familias 13, 14 y 15, respectivamente), dentro de las casi 100 familias de glicósido hidrolasas que aparecen definidas en el servidor CAZy (Machovic y Janecek, 2007).

La α-amilasa (1,4, α-glucanohidrolasa) es una enzima extracelular que hidroliza los enlaces α-1-4 glicosídicos de polisacáridos de alto peso molecular, tales como el almidón y el glucógeno, liberando glucosa y maltosa (Figura 2) (Barlow, 2000).

Figura 2. Hidrólisis del almidón

La enzima -amilasa es hidrolasa, la cual lleva a cabo la hidrólisis de los enlaces internos α-1,4-glicosídicos del almidón, para posteriormente obtener productos como glucosa o maltosa (figura 3) (Steyn & Pretorius, 1991).

Figura 3. Efecto de -amilasa sobre el almidón

Su actividad catalítica depende directamente de la presencia de calcio como cofactor, ya que con la ausencia de éste, conlleva a la pérdida de la actividad catalítica. Así mismo, la hidrólisis de almidón por parte de esta enzima depende de manera importante del efecto que pueda llegar a ocasionar la temperatura (Espitia, 2009).

Tiene un peso molecular aproximado de 50000 Daltons, la temperatura óptima donde la actividad catalítica es máxima está entre 30-39°C, de igual manera la enzima se encuentra estable cuando está sometida a soluciones con pH de 5.5 a 8, aunque su pH óptimo es 7 (Franklin, 2011; Garg & Kaur, 2013).

Las -amilasas son producidas por un gran número de microorganismos, plantas y animales; la α-amilasa y β-amilasa se obtienen de diferentes bacterias, hongos y levaduras (Pandey et al., 2000). Los principales organismos productores de amilasas se encuentran recogidos en la tabla 2:

Tabla 2. Organismos productores de enzimas amilolíticos pertenecientes a las familias 13, 14 y 15, según la clasificación de Henrissat (1991). Los códigos entre paréntesis, por ejemplo (1 AGY), indican la clave de acceso al Protein Data Bank (PDB).

Los microorganismos que no pueden incorporar nutrientes por fagocitosis y pinocitosis, se valen de exoenzimas que sintetizan en su interior y excretan al medio que los rodea para lograr que las macromoléculas del entorno puedan ser  hidrolizadas a productos finales pequeños que puedan entrar a la célula. Estas exoenzimas pueden ser liberadas totalmente al medio en el cual realizan la digestión celular.

La producción de una enzima, incluye dos etapas principales: la fermentación, en la que se multiplica el microorganismo productor de la enzima, y la de recuperación y purificación en la que se aísla la enzima y se lleva al grado de pureza adecuado para su uso.

La fermentación es un conjunto de reacciones químicas efectuadas por microorganismos mediante las cuales un compuesto orgánico se oxida parcialmente en presencia o ausencia de oxígeno para la obtención de energía química y producción de biomasa y metabolitos; entendiendo como una oxidación parcial cuando todos los átomos de carbono del compuesto son oxidados hasta formar CO2.  La descomposición de los sustratos es llevada a cabo por enzimas producidas para tal fin por los microorganismos .Una ruta bioquímica muy usada para la fermentación de la glucosa es la glucólisis, también denominada vía de Embden-Meyerhof (Madigan et al., 2003).

Una clasificación de la fermentación es según el estado del sustrato, hay en estado sólido y  sumergida.

La fermentación sumergida, o también conocida como fermentación en estado líquido es donde hay una solución de agua y de sustrato sólido (nutrientes). Los nutrientes deben ser líquidos o solubles en agua o en algunos casos que se encuentren en suspensión. Es un tipo de fermentación sencillo, con más condiciones que pueden controlarse, el producto final es más fácil de recuperar. Generalmente en este tipo de fermentación los microorganismos se desarrollan flotando en el medio de cultivo. Su desarrollo se presenta de manera típica, con fase de latencia, fase de crecimiento, fase estacionaria y la fase de muerte. Hay varios tipos de fermentación sumergida, como continúa, por lote, alimentada, dependiendo la entrada y salida del sustrato y producto. (Suárez 2012)

En los sumergidos los nutrientes se encuentran en forma soluble en un medio líquido, y en el estado sólido el sustrato es transformado por el microorganismo. La fermentación en estado sólido se caracteriza por la ausencia de agua, su proceso es más difícil de controlar.

Levaduras

Las levaduras son organismos pertenecientes al reino de los hongos, y como tales, son organismos heterotróficos por el hecho de que solo pueden alimentarse de materia ya preformada al contrario que las plantas, que son organismos autotróficos. Pero lo más conocido y comercialmente significativo de las levaduras son las especies y cepas de Saccharomyces cerevisiae (Ferrer- Francesch, 2009).

Saccharomyces cerevisiae, comúnmente conocida como la levadura del pan, vino y cerveza, es un pequeño organismo eucariota unicelular perteneciente al reino Fungi, cuya morfología es globular (Figura 4). Es una de las levaduras más utilizadas en el ámbito del laboratorio, debido a su simplicidad y rapidez de crecimiento. El hecho de ser eucariota le confiere muchas características ya conocidas, como las funciones de sus orgánulos subcelulares, citoesqueleto, regulación metabólica. Éstas levaduras se pueden encontrar en sustratos ricos en azúcares como en la superficie de frutas maduras, en los tractos gastrointestinales, en la superficie de los cuerpos de insectos, suelos e incluso ambientes acuáticos. (Kovačević, 2015).

Figura 4. Morfología microscópica a partir de un cultivo en medio de jugo de vegetales de Saccharomyces spp.Morfología microscópica a partir de un cultivo en medio de jugo de vegetales de Saccharomyces spp.

Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos hasta los aminoácidos; son capaces de utilizar una amplia variedad de azúcares como fuente de carbono y energía. Las levaduras generalmente utilizan hexosas, como glucosa y fructosa. La sacarosa es metabolizada después de una hidrólisis a glucosa y fructosa por enzimas como la -amilasa (Figura 5). Saccharomyces cerevisiae necesita de azúcares como hexosas, glucosa, fructosa, manosa, porque los L-azúcares pueden no ser fermentables por esta levadura. Puede producir y secretar enzimas como glucoamilasa y -amilasa (Steyn & Pretorius,1991).

Figura 5. Hidrólisis de almidón por -amilasa y metabolización de los

productos por Saccharomyces cerevisiae

Las levaduras se cultivan mejor en un ambiente de pH ligeramente ácido, con suministro de nutrientes necesarios y a una temperatura óptima de 25-30°C (Buitrago, 2007).

Se pueden controlar las condiciones entre el metabolismo aerobio y anaerobio, dependiendo de lo que se busque de la célula. Si se quiere favorecer la producción de dióxido de carbono y etanol entonces se favorece el metabolismo fermentativo. En cambio, si lo que se busca es aumentar la biomasa o producto celular, como proteínas, polisacáridos o vitaminas, entonces se favorece el metabolismo aerobio (CSIC, 2017).

Medio de cultivo

El medio de producción debe prepararse con base en los requerimientos nutricionales del microorganismo que se va a trabajar. De acuerdo a esto, la levadura Saccharomyces cerevisiae requiere de: carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, elementos traza, entre otros.

Es por esto que el medio de producción debe contener:

→ Almidón es la fuente de carbono. Los compuestos carbonados son utilizados a la vez como fuente de energía y de carbono por S. cerevisiae ya que necesita D-azúcares (glucosa, hexosa, manosa, etc.) porque los L-azúcares pueden ser considerados no fermentables por esta levadura (Tuite & Oliver, 1991).

→ MgSO4 es una fuente de azufre (SO4-2)que se incorpora en la célula a aminoácidos (Cis y Met) y diferentes coenzimas. También es una fuente de Mg2+, que es estabilizador de ribosomas, membranas celulares y ácidos nucleicos.

→ (NH4)2SO4también es una fuente de azufre, y de nitrógeno. Éste último es importante en los medio de cultivo para promover el crecimiento; ya que representa alrededor del 10% de peso de las levaduras, S. cerevisiae es capaz de utilizar nitrógeno en forma de ión amonio (Carballo, 2000)

→ KH2PO4 es una fuente de fósforo esencial para el crecimiento, regula la síntesis de los lípidos y los carbohidratos y mantiene la integridad de la pared celular.

→ Extracto de levadura se obtiene por autolisis o plasmólisis de las células de levadura. Su función es ser suplemento vitamínico de las peptonas, pero también aporta mezclas de aminoácidos y péptidos, y carbohidratos.

Cámara de Neubauer

La determinación de densidad celular de levaduras es principalmente realizado en cámaras de recuento, como Neubauer (Kosseva, 2016). Esto principalmente con intereses industriales.

La cámara de Neubauer es una pieza sólida de vidrio. Por la cual se extienden tres plataformas paralelas, separadas entre ellas por fosas. La plataforma central está dividida en dos partes iguales por dos cuadrículas características. Cada una de estas áreas tiene dimensiones distintas: 9 cuadros grandes de 1 mm2cada una; cada uno de esos 9 cuadros tiene 16 cuadros más pequeños con un área de 116mm2; el recuadro central es llamado RBC y está dividido en 25 cuadros medianos.

El conteo se hace en la cuadrícula central, como se haría con las células sanguíneas. Ya que el tamaño de una célula de levadura es entre 3 y 8 μm (García, 1995), muy similar al del eritrocito, que es entre 7 y 8.5 μm (Campbell, 2007). El cálculo de la densidad se realiza según lo explicado por Ghai (2012) y GAB Sistemática Analítica, de la siguiente forma:

Figura 6. Cálculo de la densidad celular

Para la producción y purificación de enzimas es necesario tener una fuente de la proteína, como tejidos de animales o microorganismos fáciles de obtener, como E. coli o S. cerevisiae. La proteína puede constituir hasta el 30% de la masa total de proteína de la célula. Generalmente se utiliza el método de clonación molecular, ya que hay un alto nivel de producción proteica y es mucho más fácil de aislar la enzima de interés (Voet, 2007).

El primer paso para extraer una proteína es tenerla en solución, que es liberarla de la célula que la contiene, por lo tanto es importante realizar una rotura celular, el método se elige dependiendo de las características de las células y la proteína que se va a aislar. En cambio cuando las enzimas son extracelulares no se requiere una rotura celular.

Una vez la proteína esté en solución se somete a centrifugación para separarla de restos celulares y aislarla del sobrenadante que contiene proteínas solubles, del precipitado que tiene los restos celulares y proteínas asociadas a la membrana, estas proteínas de membrana se someten a un tratamiento con detergentes para solubilizarlas. La centrifugación separa a los componentes con base a las diferencias de densidad, tamaño y forma. (Voet, 2007).

Posteriormente, en el dado caso de que se tenga interés en obtener el contenido enzimático de la célula, se procede a realizar una precipitación. La precipitación de proteínas puede realizarse empleando diferentes principios: desnaturalización selectiva, por afinidad y por disminución de la solubilidad.

La solubilidad, que es la capacidad de disolverse al mezclarse con un líquido, es una propiedad de la proteína de gran importancia para el precipitado, esto debido a que la proteína contiene varios grupos cargados. La sal extrae el agua unida a las proteínas y por lo tanto estas precipitan al perder solubilidad. La solubilidad es sensible a la temperatura, pH y fuerza iónica, disminuyendo o incrementando éstos factores se puede afectar la solubilidad (Quesada, 2007).

La precipitación por disminución de la solubilidad se fundamenta en que para lograr obtener un precipitado enzimático es necesario modificar las interacciones que tiene la proteína con las moléculas de agua, es decir eliminar las uniones por puentes de hidrógeno y las interacciones hidrofóbicas. En esta categoría podemos encontrar la precipitación isoeléctrica, precipitación con solventes, con polímeros no iónicos y precipitación con sales.

La técnica de precipitación con adición de sales más ampliamente utilizada es la llamada “salting out” método que utiliza la solubilidad reducida de ciertas moléculas en una solución de muy alta fuerza iónica.

El salting-out depende de la naturaleza hidrofóbica de la superficie de la proteína. Los grupos hidrofóbicos predominan en el interior de ésta, pero algunos se localizan en diferentes regiones de la superficie; el agua es puesta en contacto con la superficie, haciendo que estas regiones no queden expuestas; cuando la sal es agregada, el agua solvata los iones de la sal, y mientras la concentración de sal se incrementa, el agua es removida de los alrededores de la proteína, eventualmente exponiendo las regiones hidrofóbicas. Dichas regiones en las proteínas pueden interactuar mutuamente o con las de otras moléculas, resultando en una aglomeración. De esta forma las proteínas con regiones hidrofóbicas más abundantes forman agregados y se precipitarán más rápidamente que aquellas con pocas regiones resultando un fraccionamiento (Harris y Angal, 1995).

Figura 7. Efecto de salting in y salting out en las célula

En este método de precipitación, la proteína no es desnaturalizada y la actividad enzimática es recuperada mediante la resuspensión del pellet; adicionalmente, las sales pueden estabilizar las proteínas contra la desnaturalización, la proteólisis o la contaminación bacteriana, características que hacen de este método una alternativa fácil y confiable para la separación de proteínas.

Se ha mostrado que la mejor sal para la precipitación de proteínas es el sulfato de amonio [(NH4)2SO4]. Su solubilidad es muy alta (aproximadamente 4 M en agua pura) y varía muy poco en el rango de temperaturas de 0 a 30˚C. La densidad de una solución saturada de [(NH4)2SO4] es 1.235 g/cm3 , con una diferencia suficiente a la densidad de los agregados de proteínas (1.29 g/cm3 aproximadamente), posibilitando de esta manera una diferenciación de fases después de una centrifugación.

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural existen muchos agentes que pueden dañarla, como:

• Cambios bruscos de pH, debido a los numerosos grupos ácidos y básicos, pueden causar variaciones en su estructura.
• Temperaturas extremas, las proteínas se desnaturalizan a temperaturas cercanas a los 25 °C, por lo que la purificación de proteínas se lleva a temperaturas cercanas a 0°C.
• La acción de las proteasas que pueden desnaturalizarla.

Todo esto afecta el rendimiento de la proteína purificada. Para evitarlo se llevan a cabo en disoluciones buffer y a bajas temperaturas (Voet, 2007).

NOTA: Muchas proteínas se desnaturalizan por el contacto con la interfase aire-agua y a bajas concentraciones puede perderse una fracción significativa por adsorción a superficies, por lo que se deben manipular evitando la formación de espuma y relativamente concentradas (Voet, 2007).

Generalmente el objetivo de la purificación de enzimas es incrementar la actividad específica de una muestra hasta un valor igual al de la actividad específica de una proteína pura (Devlin, 2004). Las fases de la purificación consisten en lo siguiente:

• Fase I: Se aisla la enzima de interés, es la etapa de homogenizado, se puede realizar con una centrifugación o filtración.
• Fase II: Se eliminan impurezas, es la precipitación selectiva. Se puede precipitar con sales, solventes, temperatura o con el pH.
• Fase III: En esta fase se extrae una proteína de interés que se encuentre en cantidades muy pequeñas o requiera algún método más selectivo para purificarlo.

Finalmente después de la purificación de enzimas, se realiza la resuspensión de éstas en un buffer, de acuerdo a las características y necesidades que tenga la enzima, con el propósito de preservarla para su posterior uso.

Un buffer es una solución reguladora, la cual es capaz de mantener la acidez, basicidad o neutralidad de un medio en un intervalo de pH, esta solución reguladora se forma a partir de un par ácido/base conjugado en concentraciones determinadas (Garg & Kaur,2013).

Metodología

Diagrama 1. Producción, separación y purificación de la enzima -amilasa a partir de Saccharomyces cerevisiae por fermentación en medio sumergido

*Para preparar 100 mL del medio de producción fue necesario pesar lo siguiente:

• 0.87 g K2HPO4
• 0.2 g MgSO4
• 15.1 g  almidón
• 0.02 g extracto de levadura
• 1.32 g (NH4)2SO4

*Posteriormente a la preparación del medio y el ajuste de pH, se procedió a esterilizar durante 15 minutos en autoclave, a 15 libras y 121 °C.

*Se mantuvo la muestra después de la primera centrifugación en hielo durante su manipulación, con la finalidad de preservar la enzima y evitar someter a esta a cambios bruscos de temperatura, más adelante se explica a detalle este fenómeno que afecta a la enzima.

*Posteriormente al proceso de precipitación o purificación de la enzima,  la segunda pastilla formada como precipitado se suspendió en aproximadamente 10 mL buffer de fosfatos a 0.1 M pH 7.

La solución reguladora se preparó en un matraz aforado de 25 mL, los pesos se midieron en balanza analítica.

Resultados

Tabla 4. Absorbancias medidas en el espectrofotómetro UV-vis (método DNS)
Muestra tomada	TUBO	A
Muestra 1 (20/02/17)	Blanco	0.000
	1	0.022
	1´ (Duplicado)	0.015
Muestra 2 (22/02/17)	Blanco	0.000
	1	0.023
	1´ (Duplicado)	0.021
Muestra 3 (24/02/17)	Blanco	0.000
	1	0.011
	1´ (Duplicado)	0.004

Para determinar la concentración de glucosa con base a las absorbancias, se utilizó la gráfica de curva de calibración para glucosa usando el método DNS, realizada en el práctica 1.La ecuación de la línea recta que corresponde al gráfico ( y= 0.1475x - 0.2954; y: absorbancia, x: concentración), (en este conjunto de datos se encontró un coeficiente de correlación al cuadrado de 0.982), para encontrar la concentración de las distintas absorbancias medidas (tabla 4).

Figura 9. Gráfico de absorbancia promedio curva de calibración para azúcares reductores

Con base a la ecuación mostrada anteriormente, se obtuvo lo siguiente:

Tabla 5. Cálculo de concentración de glucosa
Muestra tomada	TUBO	A	CONCENTRACIÓN (g/L)
Muestra 1 (20/02/17)	Blanco	0.000	0.000
	1	0.022	0.118
	1´ (Duplicado)	0.015	0.110
Muestra 2 (22/02/17)	Blanco	0.000	0.000
	1	0.023	0.119
	1´ (Duplicado)	0.021	0.117
Muestra 3 (24/02/17)	Blanco	0.000	0.000
	1	0.011	0.106
	1´ (Duplicado)	0.004	0.09

Para determinar la cantidad de proteína presente en cada muestra se realizó el método Bradford, obteniendo lo siguiente:

Tabla 6. Absorbancias medidas en el espectrofotómetro UV-vis (método Bradford)
Muestra tomada	TUBO	A
Muestra 1 (20/02/17)	Blanco	-0.002
	1	-0.048
	1´ (Duplicado)	-0.016
Muestra 2 (22/02/17)	Blanco	-0.002
	1	-0.019
	1´ (Duplicado)	-0.019
Muestra 3 (24/02/17)	Blanco	-0.002
	1	-0.058
	1´ (Duplicado)	0.043

Tabla 7. Conteo de células
	Muestra (20/02/17)	Muestra (22/02/17)	Muestra (24/02/17)
Células contadas en cuadrante central de cámara de Neubauer	12 células	25 células	21 células
Densidad celular	3 millones de células/mL	6.25 millones de células/mL	5.25 millones de células/mL

Para precipitar a la enzima -amilasa del medio de cultivo primero se realizó una centrifugación a 1300 rpm por 10 minutos a 4 °C para separar la célula de la enzima presente en el medio. Posteriormente se precipitó con sulfato de amonio para realizarle una segunda centrifugación a las mismas condiciones. Se tomaron muestras del sobrenadante obtenido en la primera y segunda centrifugación, y al precipitado resuspendido en buffer para cuantificar las proteínas por el método Bradford en cada una de las etapas; el blanco utilizado fue una muestra del medio de producción preparado sin inocular. Las medidas de absorbancia para cada una de estas etapas fueron:

Tabla 8. Sobrenadante: 1° centrifugación (método Bradford)
Tubo	Longitud de onda	Absorbancia (promedio)
Blanco	595 nm	0.000
1	595 nm	0.278
2	595 nm	0.0355
3	595 nm	0.052

Tabla 9. Sobrenadante: 2° centrifugación (método Bradford) 17/03/17
Tubo	Longitud de onda	Absorbancia (promedio)
Blanco	595 nm	0.000
1	595 nm	0.906
2	595 nm	0.916
3	595 nm	0.930

Tabla 10. Precipitado enzima: 2° centrifugación (método Bradford) 17/03/17
Tubo	Longitud de onda	Absorbancia (promedio)
Blanco	595 nm	0.000
1	595 nm	0.161
2	595 nm	0.265
3	595 nm	0.167

Para cuantificar la proteína de las muestras utilizamos la curva de calibración para proteínas (para albúmina de huevo) realizada en la práctica 1, ya que es necesaria para la determinación de la concentración (Sánchez, 2013). La ecuación de la curva de calibración obtenida fue la siguiente: y=0.0021x-0.0035, donde y representa la absorbancia medida a 595 nm y x la concentración de proteína en μg/mL

Entonces, para calcular las concentraciones despejamos xde la ecuación:

Tabla 11. Concentraciones (promedio) de proteína calculadas
Muestra		x=μg/mL
Tubo 1	1° Sobrenadante	67.857
	2° Sobrenadante	446.595
	Precipitado	78.571
Tubo 2	1° Sobrenadante	18.5715
	2° Sobrenadante	438.095
	Precipitado	127.8565
Tubo 3	1° Sobrenadante	26.428
	2° Sobrenadante	444.5235
	Precipitado	81.4285

Discusión

Conclusiones

La concentración de enzima obtenida fue muy baja respecto a la bibliografía revisada, teniéndose aproximadamente un 3% de concentración de enzima en el precipitado resuspendido con respecto a la referencia utilizada. Este bajo porcentaje puede explicarse debido a que es necesario realizar más precipitaciones con sulfato y centrifugaciones, ya que en el sobrenadante obtenido de la segunda centrifugación (después de agregar sulfato de amonio) hay una mayor concentración de la enzima que en el precipitado.

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